Pengujian darah (hematologi) pada ikan, menjadi bagian penting dalam berbagai studi. Darah dapat menjadi suatu indikator adanya perubahan terhadap suatu kondisi atau perlakuan tertentu. Keakuratan hasil pengujian darah sangat bergantung pada faktor-faktor yang berkaitan dengan tehnik maupun metode pengambilan darah. Pengambilan sampel darah ikan yang tidak sesuai atau tidak sesuai kaidah dapat mempengaruhi hasil analisis. Berikut ini adalah beberapa aspek yang harus diperhatikan ketika melakukan pengambilan dan pengujian darah ikan.
Handling ikan
Pengambilan darah pada ikan dapat dilakukan dengan mengangkat ikan dari air. Namun demikian, terdapat resiko stress pada ikan sehingga pengambilan darah harus dilakukan sesegera mungkin. Pada kondisi tertentu, pengambilan darah dapat dilakukan tanpa mengangkat ikan dari air dengan merestrain ikan dengan jaring, dengan posisi kepala dan insang tetap berada di dalam air.
Tehnik pengambilan darah ikan
Pada pengambilan darah dengan tehnik potong ekor, tabung mikrokapiler disarankan digunakan untuk menghindari tercampur dengan jaringan tubuh. Tehnik pengambilan ditentukan dengan pertimbangan cepat dan jumlah yang terambil mencukupi. Saat pengambilan sampel ikan tidak boleh stress agar tidak mempengaruhi hasil pengujian. Apabila tidak dilakukan anestesi, mata ikan harus ditutup agar ikan lebih tenang.
Lokasi pengambilan darah
Pengambilan darah melalui vena caudalis paling banyak digunakan dibandingkan pengambilan darah melalui jantung ataupun pemotongan ekor. Pengambilan darah melalui vena dapat dilakukan dari sudut ventral maupun lateral dengan dan tanpa anestesi. Pemotongan ekor dapat mengakibatkan kematian pada ikan dan munculnya kontaminasi dengan jaringan tubuh. Pengambilan darah melalui jantung harus dilakukan oleh personel yang terlatih. Pengambilan darah vena meskipun banyak digunakan dapat beresiko menimbulkan stress pada ikan akibat lambatnya aliran darah vena dibandingkan mengambil darah melalui jantung. Pengambilan darah melalui vena memiliki hasil PCV, Hb, dan eritrosit yang lebih tinggi dibandingkan pengambilan darah dari jantung. Kenaikan hematokrit pada darah yang diambil melalui vena dan jantung berkaitan erat dengan handling dan waktu analisis. Handling dalam 20 detik menyebabkan pelepasan katekolamin dan cenderung menyebabkan hemokonsentrasi dan pembengkakan eritrosit. Oleh karenanya nilai hematokrit akan meningkat sedangkan hemoglobin tetap.
Alat dan Bahan pengambilan darah
Wadah yang digunakan untuk menyimpan darah ikan harus bersih, kering, dan tidak terbuat dari bahan kaca. Kontak antara darah ikan dengan kaca dapat menyebabkan pembekuan darah karena adanya faktor koagulasi XII memicu proses pembekuan darah. Oleh karena itu untuk pengambilan darah ikan disarankan untuk menggunakan tabung mikro/microtube.
Anestesi
Prosedur anestesi kadangkala digunakan sebelum pengambilan sampel darah ikan untuk mengurangi stress. Akan tetapi, anestesi atau sedasi menggunakan tricaine dapat mengakibatkan hemolisis. Hemolisis ini dapat diminimalisir dengan melakukan pendinginan sampel hingga suhu 25oC dan melakukan preparasi sampel secara cepat.
Antikoagulan
Darah pada ikan mudah untuk mengalami pembekuan. Waktu pembekuan akan lebih singkat ketika jumlah trombosit dan suhu air meningkat. Kecepatan pembekuan darah bergantung pada tingkat stress. Oleh karena itu dibutuhkan antikoagulan yang tepat untuk mendapatkan hasil yang sesuai dalam pengukuran hematologi. Tidak semua antikoagulan cocok digunakan untuk ikan. Heparin paling baik digunakan sebagai antikoagulan darah ikan meskipun darah cenderung dapat mengalami penggumpalan. Ehylenediaminetetraacetic acid (EDTA) memiliki kekurangan dapat mengakibatkan hemolisis, namun demikian EDTA pada beberapa kondisi bisa digunakan.
Volume darah
Pada sampling non lethal, volume darah yang boleh diambil maksimal 0,1% dari berat badan. Hal ini bertujuan agar ikan dapat rekoveri pasca pengambilan darah. Sampel darah ikan dapat kembali diambil namun dibutuhkan waktu bagi ikan untuk pulih dan meregenerasi volume darah.
Ukuran ikan
Ikan berukuran kurang dari 200gram harus dimatikan, untuk mencukupi volume darah yang dibutuhkan. Sedangkan ikan lebih dari 200gr dapat recoveri dengan sempurna (bergantung kondisi kesehatan sebelum sampling). Secara umum, ikan dengan panjang 3 inchi atau 8cm dapat diambil darahnya dengan aman.
Durasi pengambilan sampel
Ikan yang pengambilan darahnya tidak dilakukan anestesi, paling baik diambil darahnya segera dalam waktu kurang dari 30 detik. Hal ini bertujuan untuk menghindari stress dan ketidakseimbangan elektrolit akibat terlalu lama tidak berada di air.
Penanganan sampel
Setelah pengambilan sampel, darah harus segera dihomogenkan dengan antikoagulan untuk mencegah pembekuan. Pada ikan dengan karakter darah cepat membeku, spuit dan jarumnya dapat dilapisi dengan antikoagulan, misalnya pada ikan berukuran kecil yang darahnya lambat mengalir saat diambil. Sampel darah kemudian disimpan dalam kulkas sebelum dianalisa. Hindari sampel darah berkontak dengan air. Simpan darah dalam wadah yang bersih dan kering. Air dapat mempercepat proses pembekuan darah pada ikan.
Penyimpanan darah
Sampel darah dapat disimpan dalam kulkas dan suhu kamar untuk jangka pendek. Lama dan suhu penyimpanan dapat berbeda-beda pengaruhnya terhadap parameter hematologi. Misalnya pada sampel darah ikan bawal air tawar yang disimpan pada suhu kamar selama 10 jam tidak mempengaruhi nilai hematokrit, Hb, dan MCHC. Sementara pada ikan mas, penyimpanan darah pada suhu 22oC selama 2 jam menurunkan nilai RBC dan WBC. Sampel darah ikan rainbow trout yang disimpan pada suhu 4oC selama 7 hari dapat menurunkan nilai RBC, hematokrit, MCH dan MCHC. Sedangkan penyimpanan selama 14 hari menurunkan nilai Hb tanpa perubahan pada WBC dan MCV.
Stress
Pada ikan yang sehat dan tidak stress, pengambilan darah akan lebih cepat.Semakin tinggi tingkat stress, semakin cepat darah untuk membeku. Penggunaan anestesi disarankan untuk meminimalisir stress.
Petugas
Personel yang ahli dan terampil dapat membuat proses pengambilan sampel darah lebih cepat dan aman bagi ikan. Setiap parameter sebaiknya diamati oleh personel yang sama untuk menghindari bias dalam penghitungan dan pengamatan.
Reagen Pengencer
Terdapat berbagai jenis reagen pengencer yang digunakan dalam penghitungan eritrosit dan leukosit. Berbagai pengencer ini dapat digunakan dan tidak terdapat perbedaan dalam hasil penghitungan darah. Namun demikian, untuk penghitungan sel darah putih, larutan yang isotonis dan tidak berwarna seperti Hayem lebih baik digunakan daripada Natt-Herrick ataupun Dacie’s yang mewarnai leukosit dan inti eritrosit menjadi biru. Larutan Turk’s tidak cocok digunakan sebab apabila sel darah merah lisis, inti sel nya akan tetap berwarna ungu dan menyaru dengan leukosit.
Pengamatan sel
Gunakan berbagai sumber sebagai pembanding untuk mengidentifikasi sel darah.
Referensi
Campbell, T.W. & Ellis, C.K. 2007. Avian and Exotic Animal Hematology and Cytology Third Edition. Blackwell Publishing
Thrall, M.A., G. Weiser, R.W. Allison, T.W. Campbell (Ed). 2012. Veterinary Hematology and Clinical Chemistry second edition. Wiley-Blackwell: UK
Witeska, M., E. Kondera, K. Ługowska, B. Bojarski. 2022. Hematological methods in fish – Not only for beginners. Aquaculture 547 737498
Minister of Fisheries and Oceans. 2004. 4.0 blood Sampling of finfish . Canada Department of Fisheries and Oceans Animal User Training Template
